1. Úvod

Prírodný prášok artemisinínu 63968-64-9 je liečivá rastlina používaná v tradičnej čínskej medicíne už viac ako 2000 rokov na liečbu mnohých porúch vrátane malárie. Artemisinín je hlavnou zložkou extraktu Artemisia annua. Izoláciu artemisinínu z Artemisia annua L. a charakterizáciu jeho antimalarického účinku v 70. rokoch 20. storočia iniciovali čínski vedci, čo sa v modernej dobe považuje za jeden z najdôležitejších pokrokov v boji proti malárii. Artemisinínový prášok je široko používaný v oblasti potravín, farmácie a kozmetiky.

Artemisin je organická zlúčenina s molekulovým vzorcom C15H22O5 a relatívnou molekulovou hmotnosťou 282,34. [1]

Artemisinín je bezfarebný ihličkový kryštál s teplotou topenia 156 ~ 157 stupňov. Je ľahko rozpustný v chloroforme, acetóne, etylacetáte a benzéne, rozpustný v etanole a éteri, mierne rozpustný v studenom petroléteri a takmer nerozpustný vo vode. Vďaka svojej špeciálnej peroxyskupine je tepelne nestabilný a ľahko sa rozkladá vplyvom vlhkosti, tepla a redukčných látok. [1]

Artemisinín je najúčinnejší liek na liečbu rezistencie voči malárii. Kombinovaná terapia na báze artemisinínu je v súčasnosti tiež najúčinnejším a najdôležitejším prostriedkom na liečbu malárie. Ale v posledných rokoch, s prehlbovaním výskumu, sa čoraz viac objavujú a uplatňujú aj ďalšie účinky artemisinínu, ako sú protinádorové účinky, liečba pľúcnej hypertenzie, proti cukrovke, embryotoxicita, antimykotikum, regulácia imunity, antivírusové [{{ 1}}], protizápalové, proti pľúcnej fibróze, antibakteriálne, kardiovaskulárne účinky a iné farmakologické účinky [2].

V októbri 2015 získala Tu Youyou spolu s ďalšími dvoma vedcami Nobelovu cenu za fyziológiu a medicínu za rok 2015 za prínos k vytvoreniu nových liekov proti malárii – artemisinínu a dihydroartemisinínu. [5

Pozadie výskumu

Malária je jednou z najstarších chorôb ľudských bytostí a je stále dôležitým problémom verejného zdravia, ktorý je vo svete široko znepokojený a naliehavo treba ho vyriešiť.

V roku 1631 taliansky misionár Agostino Salumbrino získal od Peruáncov z Južnej Ameriky účinný liek na liečbu horúčky - mochna a priniesol ho späť do Európy na liečbu horúčky. Čoskoro sa zistilo, že liek má zjavný úľavový účinok na intermitentnú horúčku.

V roku 1820 Pierre Joseph, francúzsky chemik, a Joseph Bienaim é Caventou, farmaceutický vedec, izolovali účinnú zložku na liečbu malárie z kôry Cinchona a nazvali ju chinín.

V roku 1944 americkí organickí chemici Robert Woodward a William Doering prvýkrát úspešne syntetizovali chinín. Odvtedy vedci neustále zdokonaľujú antimalarické lieky, tvoria aromatické a heterocyklické metanoly reprezentované chinínom, 4-aminochinolíny reprezentované chlorochínom a heterocyklické aminofenoly reprezentované amodiachínom. Tieto antimalariká zohrali dôležitú úlohu pri kontrole ľudskej malárie. S rozsiahlym a dlhodobým užívaním liekov sa však postupne objavil problém liekovej rezistencie parazitov malárie.

Začiatkom 60. rokov 20. storočia si Plasmodium falciparum v niektorých regiónoch, najmä v juhovýchodnej Ázii, vytvorilo rezistenciu na chlorochín. V tom čase, s postupnou eskaláciou vietnamskej vojny, sužoval bojujúce strany útok malárie falciparum rezistentnej na chlorochín, čo malo za následok veľké zníženie bojových síl. Za týmto účelom investovali Spojené štáty veľa ľudských a materiálnych zdrojov do štúdia malárie, pričom hlavným cieľom bolo nájsť nové antimalariká. Medzi nimi Armádny výskumný inštitút Waltera Reeda v Spojených štátoch od konca 60. rokov preveril viac ako 200 000 zlúčenín. Kvôli obmedzeným podmienkam Vietnam nedokáže vyvinúť nové lieky, preto požiadal Čínu, aby pomohla vyriešiť problém s kontrolou malárie. Čínska strana vyslala výskumníkov, aby vykonali terénne vyšetrovanie a terénnu pomoc takmer dva roky, pričom si uvedomili naliehavosť a zložitosť boja proti malárii.

Objav artemisinínu

Od 21. mája do 1. júna 1971 sa v Guangzhou konalo Národné sympózium o kontrole a prevencii malárie. Po sympóziu Pekinský inštitút tradičnej čínskej medicíny reorganizoval výskumný tím. Tu Youyou bol stále vedúci tímu a členovia tímu Zhong Yurong pokračovali v získavaní tradičnej čínskej medicíny. Lang Linfu a Liu Jufu robili pokusy na zvieratách. Podľa záznamov o skríningu liekov Pekinského inštitútu tradičnej čínskej medicíny bola miera inhibície artemisinínu 26. júla 1971 (č. 16) 12 percent, 1. septembra 40 percent (č. 114) a 4. októbra 100 percent. (č. 191). Od januára 1971 začal tím Tu Youyou extrahovať veľké množstvo éterového extraktu z artemisia annua a koncom júna toho roku dokončil test toxicity na psoch. Aby sa klinické skúšanie uskutočnilo čo najskôr, zatiaľ čo výsledky testu toxicity extraktu éteru artemisinínu na psoch v danom roku sú stále kontroverzné, Tu Youyou, Lang Linfu, Yue Fengxian a Zhang Guozhen, Yan Shuchang, Pan Hengjie , Zhao Aihua a Fang Wenxian postupne užívali neutrálny extrakt éteru artemisinínu v dvoch dávkach v rôznych dávkach, bez zjavných toxických a vedľajších účinkov.

8. marca 1972 Tu Youyou ako zástupca Pekinského inštitútu tradičnej čínskej medicíny vypracoval správu s názvom „Použite myšlienku Mao Ce-tunga na usmernenie výskumu antimalarickej čínskej bylinnej medicíny“ na stretnutí „Národného úradu 523“ v Nanjingu a informovali o výsledkoch 100-percentnej miery inhibície malárie u potkanov a malárie u opíc neutrálneho surového extraktu éteru artemisinínu, ktoré pritiahli pozornosť všetkých účastníkov. Podľa údajov sa Tu Youyou inšpiroval tradičnou čínskou medicínou a ľudovým príslovím „žmýkať šťavu“. Vzhľadom na to, že účinné zložky môžu byť v lipofilnej časti, prešla na extrakciu éterom, ktorá výrazne zlepšila živočíšnu potenciu Artemisia annua z 30 percent na 40 percent na viac ako 95 percent.

V auguste 1972 viedol Tu Youyou tím na vykonanie testu klinickej účinnosti artemisinínového éterového neutrálneho extraktu na ostrove Hainan. Počas tohto obdobia Ni Muyun navrhol predúpravu separácie na chromatografickej kolóne, aby sa opäť zlepšil antimalarický účinok neutrálnej časti éterového extraktu Artemisia annua. Zhong Yurong sa z literatúry dozvedel, že silikagélová kolóna je účinnejšia pri separácii neutrálnych zlúčenín, a tak spolu so svojím asistentom Cui Shulianom použili silikagélovú kolónovú chromatografiu a gradientovú elúciu petroléter-etyléter (neskôr zmenený na petroléter-etylacetát) podľa na metódu poskytnutú v literatúre na oddelenie neutrálneho éterového extraktu na základe spracovania Ni Muyun na predkolóne.

8. novembra 1972 sa na separáciu použila silikagélová kolóna vyrábaná Shanghai Reagent Factory a potom sa na elúciu mnohokrát použil petroléter a etylacetát-petroléter (rôzne pomery). Najprv sa získalo malé množstvo ihličkovitých kryštálov, očíslovaných "ihlový kryštál I" (č. 1 alebo ihla 1); Počet ihličkovitých kryštálov eluovaných následne je "ihlový kryštál II" (č. 2 alebo ihla 2); Neskôr sa získal ďalší štvorcový kryštál s číslom „Crystal III“ (č. 3 alebo štvorcový kryštál). Začiatkom decembra toho istého roku test na maláriu u myší dokázal, že "ihlový kryštál II" je jediným účinným monomérom s antimalarickým účinkom. Odvtedy, keď Inštitút tradičnej čínskej medicíny v Pekingu podal správu „Národnému úradu 523“, zmenil účinnú zložku „ihlového kryštálu II“ proti malárii na „artemisinín II“, niekedy známy aj ako artemisinín. Neskôr Pekinský inštitút tradičnej čínskej medicíny nazval "artemisinín II" artemisinín.

2. Hlavná funkcia

1. Antimalarikum, prášok artemisinínu má zabíjací účinok na parazita v červených krvinkách, môže rýchlo inhibovať zrelosť parazita;

2. Antibakteriálny, artemisinín pôsobí proti vírusu chrípky;

3. Antiparazit, artemisinín o úlohe anti-schistosomiázy a leptospirózy.

3.Aplikácia

1. Prírodný prášok artemisinínu 63968-64-9 aplikovaný v oblasti potravín, prášok artemisinínu môže pôsobiť ako surovina pre čaj na zníženie hlienu;

2. Aplikovaný vo farmaceutickej oblasti sa stáva novým protirakovinovým liekom s nízkou toxicitou;

3. Používa sa v kozmetickej oblasti, môže oživiť krvný obeh a odstrániť nápoj.

4. Špecifikácia

Položky	Požiadavky	Výsledky
Popis
Vzhľad:	Biely až sivobiely kryštalický prášok.	Vyhovuje
Rozpustnosť	Voľne rozpustný v acetóne a v ľadovej kyseline octovej, rozpustný v metanole, etanole, zriedenom etanole, éteri alebo petroléter, prakticky nerozpustný vo vode	Vyhovuje
Bod topenia	150-153 stupeň	150.9-151.8 stupňa
Špecifická optika rotácia	plus 75 stupňov - plus 78 stupňov	plus 77,1 stupňa
Identifikácia
Farebná reakcia	Vznikne fialová farba	Vyhovuje
Farebná reakcia	Vznikne sýta fialovo-červená farba	Vyhovuje
HPLC	Retenčný čas hlavného píku pri príprave testu by mal sa zhoduje s pracovným štandardom získaným z testu HPLC	Vyhovuje
IR	IR spektrum vzorky by malo byť v súlade s IR spektrom pracovného štandardu artemisinínu	Vyhovuje
Testy
Súvisiace látky (HPLC)	Artemisitene Menej ako alebo rovné 0,15 percenta {{0}}epimér artemisinínu Menej ako alebo rovné 0,3 percenta Akákoľvek jednotlivá nečistota menšia alebo rovná {{0}}.15 percent Celkové nečistoty menšie alebo rovné 1,0 percenta	{{0}},07 percent NA 0,1 percenta 0,75 percent

5. Vývojový diagram

Suroviny → Čistenie → Havária → Extrakt → Filter → Koncentrát → Suché rozprašovaním → Testovanie → Balenie

Chemická syntéza

Syntéza artemisinínu z R - ( plus ) - citronellalu

Syntéza artemisinínu z R - ( plus ) - citronellalu [11]

V roku 1983 chemik HofheinzW a ďalší objavili metódu chemickej syntézy artemisinínu prostredníctvom chemického výskumu. Použitím (-) - 2- izobutanolu ako suroviny sa medziprodukt získal zavedením kyslíkových skupín prostredníctvom fotooxidačnej reakcie a potom sa konečný produkt syntetizoval prostredníctvom cyklizačnej reakcie. Pri syntéze seskviterpénových laktónov existujú dva hlavné kroky obmedzujúce rýchlosť: skladanie a cyklizácia seskviterpénových materských jadier; Proces tvorby seskviterpénových laktónov obsahujúcich peroxymosty.

V roku 1986 čínsky vedec Zhou Weishan syntetizoval artemisinín z R - ( plus ) - citronellalu. Vzhľadom na komplikované kroky syntézy a nízky celkový výťažok, dokonca menej ako 1 percento, sa však hodnotenie uskutočniteľnosti industrializácie ešte neuskutočnilo.

Biosyntéza

Artemisinín existuje v kvetoch a listoch čínskej bylinnej medicíny Artemisia annua, ale nie v stonkách. Je to terpénová zlúčenina s veľmi nízkym obsahom a jej biosyntetická dráha je veľmi zložitá.

Teraz je známe, že biosyntéza artemisinínu sa môže uskutočniť tromi spôsobmi. Jedným z nich je zvýšenie obsahu artemisinínu reguláciou kľúčových enzýmov riadiacich biosyntézu artemisinínu a pridaním prekurzorov biosyntézy; Druhým je aktivácia génov riadených kľúčovými enzýmami a výrazné zvýšenie obsahu artemisinínu; Tretím je použitie genetického inžinierstva na zmenu kľúčových génov na zvýšenie účinnosti enzýmov, ktoré kontrolujú.

V procese biosyntézy je obsah artemisinínu vo veľkej miere ovplyvňovaný fyziologickými a ekologickými faktormi ako je svetlo, exogénne hormóny, diferenciácia púčikov a pod. Veľký vplyv na biosyntézu má aj teplota. Experimentálnym výskumom sa zistilo, že obsah artemisinínu v semenákoch artemisinínu sa zvyšuje na 68 percent pri 40 stupňoch po 36-hodinovom ošetrení.

Okrem artemisinínu môžu artemisinín syntetizovať aj iné rastliny. V roku 2011 vedci syntetizovali artemisinín z tabaku. V porovnaní s tradičnými chemickými metódami sú chemické činidlá používané pri tejto metóde výrazne znížené, čo je prospešné pre ochranu životného prostredia. Receptorom tejto metódy biosyntézy je tabak, ktorý je v Číne pomerne rozšírený. Preto je zdroj surovín pomerne bohatý. Niektoré reakčné substráty v procese syntézy artemisinínu z tabaku však nie sú jasné a je potrebné ich vyvinúť. Táto syntetická metóda má však stále dobré vyhliadky na priemyselné využitie. [11]

Gén pre artemisinín sa implantuje do Escherichia coli a transformovaná Escherichia coli produkuje medziprodukt, ktorý sa po niekoľkých krokoch liečby môže stať surovinou artemisinínu - artemisinínovou kyselinou. Po vložení špeciálneho enzýmu do kvasiniek kvasinky transformovali vyššie spomínaný medziprodukt na artemisinín. Technologický reťazec výroby artemisinínu prostredníctvom mikrobiálneho priemyslu sa v podstate formoval. To znamená, že cena artemisinínu klesne o 90 percent. [12]

Extrakcia a čistenie

Separačné a purifikačné procesy zahŕňajú hlavne extrakciu pomocou rozpúšťadla, extrakčnú rekryštalizáciu, superkritickú CO2 extrakciu a rozpúšťadlovú extrakčnú chromatografiu.

Metóda extrakcie a rekryštalizácie rozpúšťadlom vo všeobecnosti využíva metódu rozpúšťadlového benzínu, metódu etanolu a metódu extrakcie alkalickou vodou a metódu zrážania kyselinou na výrobu, čo výrazne zvyšuje efektívnu mieru využitia rastlín artemisinínu.

Metóda extrakcie alkalickou vodou a kyslého zrážania: vezmite určité množstvo suchého prášku z konárov a listov Artemisia annua a pridajte ho do etanolu na miešanie a extrakciu, aby ste získali etanolový extrakčný roztok, vysušte ho pri zníženom tlaku a rozpustite v éteri. vodný dvojfázový roztok na získanie artemisinínu a artemisinínu. Výťažok artemisinínu pri tejto metóde je 90 percent a rýchlosť extrakcie artemisinínu je 57 percent.

Etanolová metóda: vezmite určité množstvo sušeného prášku z konárov a listov Artemisia annua, namočte ho do zriedeného etanolu na 24 hodín, získajte etanolový extrakt, vstreknite ho do zariadenia na kontinuálnu extrakciu a potom ho extrahujte rozpúšťadlom benzínom obsahujúcim benzén a etyl acetát, aby sa získala alkoholová fáza a extrakčná fáza, ktoré je možné recyklovať, extrakčná fáza sa odfarbí aktívnym uhlím, prefiltruje sa a rozpúšťadlo sa získa späť a potom sa získa koncentrovaný roztok a potom sa ochladí a kryštalizuje, čím sa získa hrubý kryštál artemisinínu, a potom rekryštalizovať s etanolom, aby sa získal hotový artemisinín. Táto metóda má výhody vysokého výťažku, nízkych nákladov, menšieho počtu krokov, jednoduchej obsluhy a bezpečnosti.

Metóda rozpúšťadlového benzínu: vezmite určité množstvo suchého prášku z konárov a listov Artemisia annua, namočte ho 8-10-krát do 120 # benzínového benzínu na 3-krát, získajte rozpúšťadlový benzínový extrakt, potom ho dekomprimujte a koncentrujte a umiestnite na kryštalizáciu , získajte surový artemisinín, niekoľkokrát ho premyte malým množstvom 120 # benzínu s rozpúšťadlom a 2 až 3-krát kryštalizujte 50-percentný etanolalkohol, nakoniec získajte biely ihličkový kryštál artemisinínu. Táto metóda je jednoduchá a ľahko použiteľná v hromadnej výrobe.

Existujú tri extrakčné metódy pre rozpúšťadlovú extrakčnú chromatografiu, menovite acetón - silikagélová kolónová chromatografia, nízkovriaci benzín - ultrakrátka hrubá sférická expandovaná silikagélová chromatografia a etánová extrakcia - etán/acetonitril - silikagélová kolónová chromatografia.

6. Kvalifikácia

Po rokoch výroby naša spoločnosť získala príslušnú výrobnú licenciu.

ISO